En esta secuela de Noche en el Museo, el Museo de Historia Natural cierra sus puertas para una restauración que modernizará la exhibición, y todos los artículos antiguos se trasladan permanentemente al Archivo Federal en Washington, D.C., situado en el Museo Smithsonian. Pero la tablilla mágica viaja con ellos, y pronto el caos se desata en la capital, ya que el Smithsonian es la sede donde descansa Kahmunrah, el hermano malvado del faraón que poseía el amuleto en Nueva York. Ahora, para que conseguir salvar a sus amigos y que Kahmunrah no despierte al ejército de Anubis, Larry Daley tendrá que introducirse en el museo y recuperar la tablilla.